Gram-Staining

1884年丹麥醫生Gram發明 Gram-Staining，至今仍為鑑別細菌之重要方法。

依據 Gram-staining我們可將細菌分為兩類，一為Gram-positive，一為Gram-negative。

其染色原理至今未明，推測其與此二類細菌之細胞壁結構有重大關係。
說法有二:
 其一為：
 Gram-negative 細菌之細胞壁含脂量高，以酒精處理時會將部份脂質(lipid)萃取出來，而使細胞壁結構鬆動，通透性(permeability )增加，故crystal violet-I複合體被帶出細菌體外而無色。
 Gram-positive 細菌之細胞壁幾乎不含脂質，酒精甚至會使細胞壁脫水，故結構更形緻密，Crystal violet-I複合體就被留在細菌體內。
 其二為：酒精處理時，會使 peptidoglycan空隙縮小；Gram-positive 細菌之 peptidoglycan wall 較厚而Gram-negative者較薄，所以Crystal violet-I複合體離開Gram-negative細菌的機會較大(�)。

Step:

1. 收集細菌細胞體。(用離心的方法)
2. 將細菌細胞重新懸浮於43.2ml不含yeast extract之LB培養液中，待細胞散置均勻後再倒至另一已有6.8ml，37%HCHO之燒瓶中，充分搖晃燒瓶使HCHO作用完全而均勻。
3. 5-15分鐘後，將HCHO固定液清洗乾淨，使細胞再度懸浮於蒸餾水中。
4. 用移植針沾一點細胞懸浮液抹在載玻片上，抹上1cm的薄片。
5. 風乾後，細菌標本朝上，迅速通過酒精燈火焰數次，使細菌抹片。固定在載玻片上。
6. 染色時先在抹片上滴一滴Crystal violet staining，1分鐘後以蒸餾水慢慢洗去，並用吸水紙吸乾水分。
7. 在抹片上再滴一滴iodine mordant，1分鐘後以蒸餾水慢慢洗去，亦用吸水紙吸乾水分。
8. 將載玻片浸泡於95% Ethanol中，並在其中慢慢晃動，30秒後拿出，用吸水紙吸乾。
9. 滴一滴counter stain在抹片上，10秒後用蒸餾水慢慢洗至廢水無色，隨後用水吸乾在光學顯微鏡下觀察。

        (引用自基礎生命科學實驗)